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蛋白质印迹法介绍

印迹法(blotting)指的是往固相载体上转移样品,之后通过相应的探测反应来进行样品的检测的一种方法。

1975年,往硝酸纤维素膜(NC膜)上转移DNA,并且通过DNA-RNA杂交来对特定的DNA片段进行检测的方法被Southern建立了,被叫做Southern印迹法。在此之后,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分、对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析以及对RNA的印迹分析也被使用了类似的方法,这些方法分别叫做Eastern印迹法、Western印迹法以及Northern印迹法。


蛋白质印迹法首先是从凝胶中向硝酸纤维素膜上转移电泳后分离的蛋白质,一般分为毛细管印迹法和电泳印迹法两种方法。


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毛细管印迹法

毛细管印迹法是在由缓冲液浸湿的滤纸上放置凝胶,将一片硝酸纤维素膜放置在凝胶上,然后再将一层吸水物质(如滤纸等)放在上面并且使用重物将其压好,那么在过毛细作用下缓冲液就会从凝胶流过,当缓冲液从凝胶经过的时候,蛋白质就会被其带到硝酸纤维素膜上,通过疏水,硝酸纤维素膜能够和蛋白质相互作用使得不可逆的结合形成。这个过程持续过夜,就能够往硝酸纤维素膜上转移凝胶中的蛋白质,然而这种方法具有比较低的效率,一般仅仅有10%~20%蛋白质从凝胶中被转移。


电泳印迹法

若想要更快速有效的进行转移,就可以使用电泳印迹法。这种方法是凝胶和硝酸纤维素膜被有孔的塑料和有机玻璃板夹成“三明治”形状,在此之后往两个平行电极中间的缓冲液中浸入,进行电泳。为了使得蛋白质从凝胶离开在硝酸纤维素膜结合,需要对电泳方向进行适当的选择。

印迹(blot)就是转移后的硝酸纤维素膜的一个称谓,被用来进一步检测蛋白质。首先用蛋白溶液(如10%的BSA)对印迹进行处理,从而将硝酸纤维素膜上剩余的疏水结合位点封闭掉,之后处理使用所要研究的蛋白质的抗血清(一抗),在印迹中,其它蛋白质不与一抗结合,与一抗结合的只有待研究的蛋白质,如此,将未结合的一抗清洗去除之后,印迹中结合着一抗的就仅有待研究的蛋白质的位置。进一步用适当标记的二抗来对处理过的印迹进行处理,一抗的抗体指的就是二抗,就相当于如果是从鼠中获得的一抗,那么抗鼠IgG的抗体就是二抗,在处理之后,一抗的位置,也就是待研究的蛋白质的位置能够通过带有标记的二抗与一抗结合被指示出来。


2019-08-29 17:58:51 浏览次数:90次
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